小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)是通過(guò)Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生腫瘤后得到的細(xì)胞株。其在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用十分普遍,是許多白血病相關(guān)研究模型的常用細(xì)胞株,在微生物學(xué)、免疫學(xué)等研究中也十分常用。但RAW264.7細(xì)胞形態(tài)和分化狀態(tài)多變,在實(shí)際培養(yǎng)中較難把握,給科研工作帶來(lái)了一定困難;且RAW264.7細(xì)胞很難轉(zhuǎn)染,許多研究者表示Lipofectamine 2000根本轉(zhuǎn)不進(jìn)去,或者僅有不到10%的轉(zhuǎn)染效率。因此RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法就很值得去探討,本文就這些方面進(jìn)行介紹,以供科研工作者借鑒。
一、RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)特征
很多人養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞出現(xiàn)偽足;就連ATCC的描述也稱(chēng)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)多樣,可有圓形、類(lèi)圓形,以及長(zhǎng)出偽足的長(zhǎng)梭形、多邊形,可單核可多核。而實(shí)際,有偽足的情況是RAW264.7細(xì)胞受到外界刺激進(jìn)行了分化,是細(xì)胞衰老、分化的表現(xiàn);RAW264.7細(xì)胞的“較佳”形態(tài)應(yīng)是較小的單核圓形細(xì)胞
二、RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)條件
RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境與一般貼壁細(xì)胞并無(wú)差異。即培養(yǎng)箱溫度為37℃,CO2濃度為5%。ATCC推薦的培養(yǎng)基為DMEM+10%的胎牛血清;實(shí)際上,經(jīng)研究者們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖型DMEM培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁更快、細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。因此,推薦使用高糖型DMEM,FBS濃度為10%,作為RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)基。
三、RAW264.7細(xì)胞的傳代
關(guān)于RAW264.7細(xì)胞的傳代方法,ATCC推薦使用細(xì)胞刮刀。也可采用0.25%的胰酶消化或采用彎嘴吸管吹打等方法。采用細(xì)胞刮刀進(jìn)行傳代時(shí),細(xì)胞能較大限度被收集起來(lái),但會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷、影響細(xì)胞形態(tài)及貼壁時(shí)間等。采用胰酶消化時(shí),由于RAW264.7細(xì)胞貼壁較牢,消化時(shí)間就較長(zhǎng)。但消化時(shí)間點(diǎn)不易把握,易消化過(guò)度,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成抑制。
因此,推薦使用彎嘴吸管吹打進(jìn)行傳代。具體做法是,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到傳代密度時(shí),先棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS洗滌兩次,用彎嘴吸管吸取培養(yǎng)基,均勻、稍用力吹打瓶底,即可將細(xì)胞吹打下來(lái)(吹不下來(lái)的就不要了),離心后重懸即可分瓶培養(yǎng)。2 h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁。
由于RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快,一般1-2d換液1次,密度長(zhǎng)至60%-70%左右即可傳代,傳代比例可為1:3-1:6。若傳代間隔太久,細(xì)胞生長(zhǎng)密度過(guò)大,細(xì)胞也容易發(fā)生分化,出現(xiàn)長(zhǎng)偽足的多形細(xì)胞。
四、RAW264.7細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇
RAW264.7細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇方法與一般貼壁細(xì)胞并無(wú)較大差別。但由于RAW264.7細(xì)胞對(duì)外界刺激較敏感,對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求較高,許多人建議降低DMSO的濃度,增加FBS血清的濃度。因此凍存液的推薦配方為5% DMSO和20% FBS的培養(yǎng)基(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞的培養(yǎng)及其在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞中的應(yīng)用,許丹等,中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2016, 10, 22, 10)。
五、RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
(一)以往轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)
RAW264.7細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞,有很強(qiáng)的貼壁性和偽足產(chǎn)生性,其轉(zhuǎn)染較難,一般采用電轉(zhuǎn)或慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法。有研究者對(duì)RAW264.7細(xì)胞用幾種不同的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行處理,對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Lipofectamine 2000, Invitrogen)效率較低,僅為12.17±1.53%,慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高,可達(dá)34.75 ± 5.30%,羅氏轉(zhuǎn)染(X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent, Roche)和電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別為16.52 ± 3.86%和15.73 ± 3.29%(巨噬細(xì)胞RAW264.7不同轉(zhuǎn)染方法的比較,李亞等,生物技術(shù),2014, 24, 2)。
(二)高效轉(zhuǎn)染試劑
既然RAW264.7細(xì)胞這么難轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)還得繼續(xù),那怎么辦呢?
不要擔(dān)心,現(xiàn)在ZETA LIFE新推出一款Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑。其廣泛適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,可轉(zhuǎn)DNA、RNA,也可共轉(zhuǎn)染,還可進(jìn)行小動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染。
這一款轉(zhuǎn)染試劑有以下幾個(gè)特點(diǎn):
1.適用細(xì)胞廣
廣泛用于293T,9L,A172, A375, A549, COS7, CHO-K1, C6S, C2C12, NIH3T3, RG2, T98G, U87, U118, MDCK, MCF-7, HT1080, HEK, H4, RAW264.7等多種細(xì)胞系。
2.細(xì)胞毒性低
其細(xì)胞存活率可高達(dá)98%,平均細(xì)胞存活率可達(dá)80%。
3.轉(zhuǎn)染效率高
其轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)96%,平均轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%。
(三)Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)RAW264.7的實(shí)例(來(lái)自實(shí)驗(yàn)者的實(shí)際數(shù)據(jù))
由上圖可明顯看出Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑對(duì)RAW264.7轉(zhuǎn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)95%以上,且細(xì)胞存活率較高。
相信Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑 將是您對(duì)的選擇,希望能為您的研究助力。
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